文丨不知名帥寶

編輯丨不知名帥寶

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前言

微生物細胞壁對于維持細胞形狀和抵抗外部應激源至關重要。細胞壁的主要結構成分是肽聚糖，一種位于細胞膜外的具有肽交聯的糖聚合物。肽聚糖的生物合成和結構對不斷變化的環境條件有反應但這種適應的潛在機制尚不完全清楚。

肽聚糖和其他細胞表面糖聚合物的前體在細胞質中合成，然后通過與可回收脂質載體磷酸十一碳烯酯結合的細胞膜傳遞。將含有DUF368和DedA跨膜蛋白家族確定為候選C55-P轉位酶，填補了微生物細胞表面聚合物生物合成所需蛋白質知識的關鍵空白。

缺乏同源含DUF368蛋白的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌表現出依賴堿性的細胞壁和活力缺陷，以及細胞表面C55-P水平升高。含DUF368的蛋白質與DedA家族成員之間的pH依賴性合成遺傳相互作用表明，C55-P轉運蛋白的使用是動態的，并受環境輸入的調節。霍亂病原體需要C55-P轉運蛋白活性才能在腸道中生長和維持細胞形狀。

磷酸化十一碳烯基脂質作為可回收載體分子在微生物細胞表面糖聚合物生物發生中具有重要作用7。在肽聚糖生物合成過程中，在細菌細胞質中組裝的肽聚糖的糖聯五肽亞基與C55-P共價連接，用于跨膜轉運。

在MurJ8將載體連接的肽聚糖前體從膜的內葉移動到外葉后，隨后將胞肽摻入聚合的肽聚糖中，留下C55焦磷酸鹽。膜相關磷酸酶包括UppP和PAP2結構域蛋白PgpB、YbjG和LpxT7將C55-PP水解為C55-P，從而引發載體循環。

C55-P可能會翻轉回膜的細胞質表面以完成回收。初步結構研究提出，UppP也可作為C55-P轉位酶發揮作用，但尚未確定負責C55-P內化的蛋白質。C55-P回收是肽聚糖和其他細胞表面糖聚合物生物合成的關鍵步驟。鑒于其在細胞表面維護中的廣泛和關鍵作用，C55-P回收被認為是抗菌療法的重要目標，并且已經確定了抑制該過程的天然抗生素。

霍亂弧菌是導致腹瀉病霍亂的革蘭氏陰性病原體，在進入、轉運和離開宿主胃腸道時，其pH值和離子濃度會發生劇烈變化。各種傳感和信號網絡使霍亂弧菌能夠適應不斷變化的環境。

病原體通過使用鈉動力而不是質子動力來響應改變的鹽度和pH值，從而為蛋白質分泌和鞭毛依賴性運動提供動力，并調節毒力基因表達。霍亂弧菌的肽聚糖組成被認為受環境輸入的影響，但pH值對霍亂弧菌的影響細胞壁生物學未知。

DUF368影響霍亂弧菌堿性適應性

最近一項針對當代霍亂弧菌臨床分離株腸道定植決定因素的體內轉座子插入測序篩選確定了許多以前與霍亂弧菌發病機制無關的基因，包括幾個功能未知的基因座。選擇這些基因之一vca0040進行進一步研究，因為類似的數據集表明霍亂弧菌中對該基因座的普遍需求腸道定植。

VCA0040被預測為一種多通道內膜蛋白，包含功能未知的廣泛保守結構域DUF368。VCA0040的預測結構模型具有大的假定裂縫，具有配體結合或轉運活性的結構域特征。缺乏VCA0040的霍亂弧菌菌株表現出穩定期生長缺陷，并伴有明顯的細胞形狀表型，vca0040細胞變成大球體。這些球形霍亂弧菌是有活力的并產生正常的桿狀子細胞。

固定相特異性因素可能會觸發vca0040細胞的形狀缺陷。指數生長的vca0040細胞暴露于來自靜止期培養物的無細胞廢上清液會迅速誘導球體形成。熱不穩定和高分子量因子，以及調節固定相肽聚糖成分的D氨基酸被排除在外。

在LB培養物中，霍亂弧菌進入穩定期伴隨著培養基堿化。由于在中性緩沖M9培養基中觀察到最小的形狀缺陷，假設vca0040細胞對堿敏感。將M9培養基緩沖至不同的pH值顯示在pH8時存在生長缺陷，但在pH6或pH7時則沒有，并且無細胞廢上清液的酸化消除了球體誘導表型。

在緩沖的LB中，vca0040細胞在pH高于8時表現出生長和細胞形狀缺陷，但在pH值高達時沒有。含有DUF368的蛋白質VCA0040是霍亂弧菌細胞形狀完整性和堿性條件下生長所必需的。

DUF368突變體中改變的肽聚糖

DUF368結構域在整個弧菌科幾乎普遍保守，并且存在于棲息在廣泛生態位的數千種其他革蘭氏陰性、革蘭氏陽性和古細菌物種中。革蘭氏陽性或古細菌DUF368同系物的異源表達至少部分補充了vca0040霍亂弧菌細胞的堿性生長缺陷。兩種同源物都顯示出與VCA0040的預測結構相似性，表明含有DUF368的蛋白質功能不僅在革蘭氏陰性和革蘭氏陽性物種之間，而且在整個微生物界中都是保守的。

由于維持細菌細胞形狀需要肽聚糖，假設DUF368功能影響細胞壁。vca0040突變體的肽聚糖比野生型少1.5-2倍，并且適度的交聯缺陷與肽聚糖前體UDP-N-乙酰胞壁酰五肽的同時積累，表明交叉上游的肽聚糖生物合成缺陷-鏈接。

這些表型存在于中性pH值下，并因暴露于堿性條件而加劇。與DUF368功能保守的觀點一致，S.aureus缺乏SAOUHSC_00846也有堿性生長缺陷、肽聚糖數量減少、UDP-M5積累和交聯減少。從這些數據中得出結論，有條件地需要含有DUF368的蛋白質來維持肽聚糖的產生和組成。

DUF368突變體中C55-P循環受損

另外兩個觀察集中了對DUF368結構域在細胞壁組裝上的研究。觀察到雖然大多數含DUF368的蛋白質主要由一個或兩個DUF368結構域組成，但一些微生物編碼具有DUF368-PAP2、PAP2-DUF368或DUF368-BacA結構的雙結構域蛋白質。

在vca0040霍亂弧菌的球體形成過程中，pgpB大約有十倍的誘導，它編碼C55-PP磷酸酶20。盡管DUF368與C55相關過程存在這些關聯，但vca0040突變體在一系列肽聚糖靶向抗生素的最小抑菌濃度中僅表現出輕微增加，這可能是因為大多數細胞壁作用化合物無法穿透革蘭氏陰性外膜。

在金黃色葡萄球菌中進行的MIC篩選顯示，在堿性條件下，SAOUHSC_00846突變體對安福霉素的敏感性遠高于野生型。安福霉素是一種Ca2+依賴性脂肽抗生素，可特異性結合細胞質膜外層的C55-P并抑制其再循環。

與之前的數據一致，已知安福霉素可誘導UDP-M5積累并減少金黃色葡萄球菌中的肽聚糖交聯24。SAOUHSC_00846突變體還對衣霉素適度敏感，衣霉素抑制壁磷壁酸和肽聚糖合成的第一個定向步驟和C55-P依賴性步驟以及桿菌肽，桿菌肽結合C55-PP并防止細胞外表面產生C55-P膜。

其他肽聚糖靶向分子的MIC變化很小，為了測試DUF368在革蘭氏陰性生物體中的功能，在可滲透外膜并對安福霉素敏感的大腸桿菌菌株lptD421327中異源表達SAOUHSC_00846或vca0040。在lptd4213大腸桿菌中表達任一含DUF368的蛋白質都賦予了兩性霉素抗性。

肽聚糖組成和抗生素敏感性數據間接表明C55-P循環在SAOUHSC_00846突變體中受損，特別是在C55-P再內化中。量化了來自野生型和SAOUHSC_00846培養物的膜脂提取物中的C55種類。

野生型金黃色葡萄球菌的安福霉素處理導致C55-P和革蘭氏陽性限制性C55-P前體C55-OH28顯著積累。該表型在SAOUSHC_00846金黃色葡萄球菌細胞中復制，該細胞在堿性培養基中生長，但在中性條件下不復制或互補菌株，提供了C55-P穩態與SAOUSHC_00846相關的直接證據。

還觀察到vca0040霍亂弧菌中C55-P的類似堿依賴性增加。為了具體量化細胞膜外葉中的C55-P，合成了熒光素偶聯的兩性霉素并用它來標記活細菌細胞。Ampho-FL標記的SAOUHSC_00846金黃色葡萄球菌在堿性培養基中表現出相對于野生型細菌的信號增加，表明突變體中表面C55-P水平有條件地升高。

這些觀察結果表明，在含有DUF368的蛋白質突變體中，表面C55-P的堿性積累會引起C55-P合成的補償性但最終不足的增加，從而導致表面糖聚合物生產缺陷和生長受損。這些發現與模型一致，其中含有DUF368的蛋白質是在堿性條件下活躍的C55-P循環轉運蛋白。

DUF368和DedA之間的遺傳相互作用

由于C55-P回收被認為是一項基本功能并且DUF368突變體有條件地可行，接下來進行了合成轉座子篩選以定義vca0040的遺傳網絡。許多已確定的合成病態或致死相互作用與細胞包膜穩態有關。

vca0040與N900_RS16280的相互作用最強，它編碼大腸桿菌DedA家族成員YghB的同系物。霍亂弧菌表達另外兩種DedA蛋白，但這些在這個屏幕上沒有命中。DedA家族跨膜蛋白在生命的所有三個領域都是保守的，通常是細胞包膜穩態所必需的，并且被懷疑介導PMF依賴性轉運，但它們的具體底物未知。

盡管大多數包含DedA的序列僅編碼該域，但有許多域架構實例，其中DedA融合到C55-PP磷酸酶域PAP2。vca0040和yghB的合成致死性通過遺傳耗竭和相互合成轉座子篩選得到驗證，YghB的過表達挽救了vca0040霍亂弧菌的堿性缺陷。

在金黃色葡萄球菌中也觀察到了DUF368和DedA蛋白之間的相互作用。在SAOUHSC_00846金黃色葡萄球菌的富堿自發抑制因子中，發現編碼兩種金黃色葡萄球菌DedA蛋白的基因中頻繁出現啟動子突變。

將這些突變納入表達任一DedA蛋白的異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷誘導系統甚至在沒有誘導的情況下也拯救了SAOUHSC_00846，這表明分離的突變增加了基因表達并補償了SAOUHSC_00846的缺失，如V.霍亂桿菌。

這些遺傳學研究表明DedA家族成員也是C55-P易位所必需的，這與最近的報道一致，即真核DedA蛋白與脂質轉運相關，而細菌DedA突變體在C55載體依賴性脂多糖修飾中存在缺陷。

lptd4213大腸桿菌的堿性安福霉素敏感性也支持pH依賴性轉位酶貢獻的概念，該大腸桿菌僅具有DedA旁系同源物并且沒有同源含DUF368的蛋白質。缺乏yghB和vca0040的菌株在酸性pH條件下存活，表明至少一種其他霍亂弧菌蛋白可以進行C55-P易位，或者C55-P可以在酸性條件下自發地穿過膜。

結論

提出含有DUF368和DedA家族的蛋白質是C55-P轉位酶，在包膜維護的這一關鍵步驟中提供功能彈性。C55-P轉運蛋白的鑒定暫時填補了C55脂質載體循環途徑中的一個主要空白。由于的遺傳和表型數據沒有明確排除運輸獨立活動，需要生化和結構研究來確認這兩個家族是否確實執行此功能。

這些候選易位酶對適應性的貢獻的表觀pH和離子依賴性表明這些蛋白質可以在能量上受到控制，因為pH對微生物細胞的主要影響是跨膜離子梯度的控制。含DUF368的蛋白質似乎在PMF較低的堿性條件下貢獻最大，如果C55-P易位是能量依賴性的，DUF368介導的轉運可能取決于SMF或其他非PMF能量梯度。

vca0040霍亂弧菌對鈉離子濃度增加的敏感性以及DUF368在其他已知嗜鹽菌如金黃色葡萄球菌和古細菌類嗜鹽菌中的明顯富集表明，無論它們的能量輸入如何，含DUF368蛋白質可能促進微生物適應高鹽環境。

VCA0040對霍亂弧菌貢獻的鈉和pH依賴性生理學可能反映了霍亂病原體在人類小腸中定殖的強大能力，其中可能會出現堿性條件和毫摩爾級鈉濃度。除了冗余易位酶的可變保守性，額外的輸入和適應機制也可能影響C55-P循環如何促進微生物適應性。

雖然vca0040僅在霍亂弧菌的堿性條件下需要，但即使在中性pH值下，該基因在相關病原體副溶血性弧菌中也是必不可少的，盡管yghB是保守的和抑制基因座，表明DUF368家族活動占主導地位的pH設定點不是普遍的。

盡管含有DUF368的蛋白質——在同時報道的工作中已更名為聚異戊二烯磷酸轉運蛋白蛋白質，僅限于細菌和古細菌，但DedA家族成員廣泛存在于真核生物中，研究結果可能會影響對聚異戊二烯磷酸酯在所有生命王國中易位的理解。

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轉載自頭條號：不知名帥寶。（侵刪）